本周六開(kāi)講！植物基因組編輯高級(jí)培訓(xùn)班~
通過(guò)基因組編輯技術(shù)修飾目標(biāo)基因在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中具有廣闊前景。典型的基因組編輯使用位點(diǎn)定向核酸酶（site-directed nucleases SDNs），如成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced palindromic repeats CRISPR）相關(guān)蛋白9（CRISPR-associated protein 9 Cas9），在基因組特定位置產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DNA double- strand breaks DSBs），進(jìn)而通過(guò)修復(fù)過(guò)程中的錯(cuò)誤引發(fā)DNA突變。通過(guò)SDNs進(jìn)行的基因組編輯產(chǎn)生的突變可分為三類。SDN-1突變通常是通過(guò)非同源末端連接修復(fù)DNA時(shí)產(chǎn)生的短缺失或插入。SDN-2和SDN-3突變則通過(guò)同源定向修復(fù)實(shí)現(xiàn)，將外源DNA序列引入基因組。盡管攜帶SDN-1型突變的基因組編輯植物是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生的，但只要其轉(zhuǎn)基因成分已被分離，這些植物在許多國(guó)家并未受到嚴(yán)格監(jiān)管，且社會(huì)接受度較高。因此，SDN-1基因組編輯對(duì)作物改良非常重要。目前已開(kāi)發(fā)出許多SDN-1基因組編輯株系。然而，迄今為止開(kāi)發(fā)的大多數(shù)SDN-1基因組編輯株系攜帶的是功能缺失突變，使得研究人員常常為基因編輯只能敲除基因而煩惱。
近日，日本廣島大學(xué)和高知大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《Plant Biotechnology Journal》在線發(fā)表了一項(xiàng)突破性研究成果“Promoter replacement by genome editing creates gain-of-function traits in Arabidopsis”，研究人員通過(guò)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的染色體倒位，成功替換了擬南芥中兩個(gè)基因的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了“早開(kāi)花”這一功能增益性狀，且無(wú)需引入外源DNA。
同一染色體上的兩個(gè)DSBs可能導(dǎo)致缺失或倒位，已有研究報(bào)道利用CRISPR-Cas9在植物中實(shí)現(xiàn)此類倒位。由于這種修飾不涉及外源DNA序列，因此被視為SDN-1型突變。大多數(shù)誘導(dǎo)倒位會(huì)導(dǎo)致功能缺失突變。然而，若倒位導(dǎo)致目標(biāo)基因編碼區(qū)與另一基因的啟動(dòng)子融合，則可能影響目標(biāo)基因的表達(dá)，從而引發(fā)表型變化。
為驗(yàn)證這一可能性，研究人員嘗試在模式植物擬南芥中通過(guò)靶向倒位替換同一染色體上兩個(gè)基因的啟動(dòng)子。利用CRISPR-Cas9在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近引入DSBs。研究人員選擇1號(hào)染色體上的開(kāi)花位點(diǎn)T（FLOWERING LOCUS T，F(xiàn)T）作為目標(biāo)基因。FT編碼成花素，過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致極早開(kāi)花。作為啟動(dòng)子供體，選擇了距離FT約3.6 Mb，兩基因呈反向排列編碼組蛋白H2A變體的HTA3基因。HTA3在多種幼嫩組織中表達(dá)，其功能缺失突變體表現(xiàn)正常生長(zhǎng)。因此，若在兩基因間包含其啟動(dòng)子的3.6 Mb片段發(fā)生倒位，將導(dǎo)致啟動(dòng)子交換，使FT受HTA3啟動(dòng)子調(diào)控。為此，設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNAs，分別在FT和HTA3的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近引入DSBs（圖1a，b）。
在這一策略中，HTA3啟動(dòng)子與FT編碼區(qū)（H-F連接）融合，而FT啟動(dòng)子則與HTA3編碼區(qū)（F-H連接）融合。采用多重基因分型PCR檢測(cè)H-F融合結(jié)構(gòu)和F-F野生型結(jié)構(gòu)（圖1a，c，d）。對(duì)170個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系的混合DNA樣本進(jìn)行PCR基因分型，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)包含6個(gè)單株的混合樣本中存在H-F融合（圖1d）。這6個(gè)單株中有一個(gè)顯示H-F融合陽(yáng)性信號(hào)（圖1e）。我們從該植株收集種子，對(duì)14株植株進(jìn)行H-F融合基因分型，并在短日照條件下觀察其開(kāi)花時(shí)間。所有攜帶至少一個(gè)H-F融合拷貝的個(gè)體均提前開(kāi)花，而無(wú)H-F融合的個(gè)體開(kāi)花時(shí)間正常。因此，H-F融合可遺傳并與早花表型相關(guān)。
對(duì)H-F融合的PCR片段測(cè)序證實(shí)，HTA3啟動(dòng)子與FT編碼區(qū)融合，并伴有9 bp缺失（圖1b）。在F-H融合中，對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物的測(cè)序檢測(cè)到FT啟動(dòng)子與HTA3編碼區(qū)在預(yù)期斷點(diǎn)位置精確融合。這些結(jié)果表明，該個(gè)體中發(fā)生了FT和HTA3之間3.6 Mb基因組片段的倒位；進(jìn)一步通過(guò)全基因組測(cè)序驗(yàn)證了這一結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)中的倒位效率為0.65%。
通過(guò)將攜帶倒位的雜合植株與Col-0雜交，獲得了無(wú)CRISPR-Cas9轉(zhuǎn)基因的分離群體。盡管開(kāi)花表型表現(xiàn)為半顯性，但倒位存在與早花表型完全一致（圖1g）。用包含倒位的基因組片段轉(zhuǎn)化的Col-0植株表現(xiàn)出早花表型，證實(shí)倒位導(dǎo)致提前開(kāi)花。
在短日照條件下，野生型中FT不被誘導(dǎo)表達(dá)，但在倒位純合植株中FT表達(dá)水平較高（圖1h）。因此，F(xiàn)T的異位表達(dá)可能是攜帶倒位植株早花表型的原因。RT-PCR表明，倒位株系中產(chǎn)生的FT轉(zhuǎn)錄本包含完整的編碼序列。
在短日照條件下，所有無(wú)轉(zhuǎn)基因的倒位純合植株的開(kāi)花時(shí)間與過(guò)表達(dá)FT的轉(zhuǎn)化株一樣早（圖1i）。倒位株系的早花表型穩(wěn)定遺傳，而CaMV35S:FT植株的開(kāi)花時(shí)間變異較大，部分植株開(kāi)花時(shí)間與Col-0相近，表明轉(zhuǎn)基因可能存在沉默現(xiàn)象。攜帶倒位的無(wú)轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)和育性與野生型相當(dāng)（圖1j）。這些觀察結(jié)果表明，本文提出的基因組編輯倒位系統(tǒng)可在不影響其他性狀的情況下，引入具有穩(wěn)定農(nóng)業(yè)重要性狀的功能增益突變。
本研究成功利用擬南芥中的SDN-1基因組編輯修飾了目標(biāo)基因的表達(dá)，而此前主要通過(guò)創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因生物實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。該系統(tǒng)具有潛在的應(yīng)用。例如，通過(guò)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的倒位過(guò)表達(dá)除草劑靶標(biāo)基因開(kāi)發(fā)出抗除草劑水稻株系。除過(guò)表達(dá)外，通過(guò)選擇合適的啟動(dòng)子，還可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因組織特異性或誘導(dǎo)性表達(dá)的修飾。結(jié)合其他技術(shù)（如誘導(dǎo)易位）的開(kāi)發(fā)，可通過(guò)增加啟動(dòng)子的可用性擴(kuò)展該系統(tǒng)的適用范圍。此外，最近報(bào)道的在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)程序化重組的Bridge RNA系統(tǒng)也可整合到該系統(tǒng)中，為作物改良帶來(lái)創(chuàng)新。
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70123
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